藥品領域的微生物檢測

微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括細菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。
儀器有微生物限度檢查儀，集菌儀、無菌集菌器
微生物限度檢查應在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度 100級的單向流空氣區(qū)域內進行。檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標準進行潔凈度驗證。
供試品檢查時，如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑，應證明其有效性及對微生物無毒性。
除另有規(guī)定外，本檢查法中細菌及控制菌培養(yǎng)溫度為30℃～35℃；霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為23℃～28℃。
檢驗結果以 1g、1ml、10g、10ml或10cm2 為單位報告，特殊品種可以小包裝單位報告。
檢驗量
檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g、ml 或cm2）。
除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗量為10g 或10ml；膜劑為100cm2；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗量應增加20g 或20ml（其中10g或10ml用于陽性對照試驗）。
檢驗時，應從2 個以上小包裝單位中抽取供試品，膜劑還不得少于4 片。
一般應隨機抽取不少于檢驗用量（兩個以上小包裝單位）的3 倍量供試品。
供試液的制備
根據(jù)供試品的理化特性與生物學特性，采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時，應均勻加熱，且溫度不應超過45℃。供試液從制備至加入檢驗用培養(yǎng)基，不得超過1 小時。
除另有規(guī)定外，常用的供試液制備方法如下。
1.液體供試品
取供試品10ml，加pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，作為1∶10 的供試液。油劑可加入適量的無菌聚山梨酯80 使供試品分散均勻。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。
2.固體、半固體或黏稠性供試品
取供試品10g，加pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻，作為1∶10 的供試液。必要時加適量的無菌聚山梨酯80，并置水浴中適當加溫使供試品分散均勻。
3.需用特殊供試液制備方法的供試品
(1)非水溶性供試品
方法1 取供試品5g（或5ml），加至含溶化的（溫度不超過45℃）5g 司盤80、3g 單硬脂酸甘油酯、10g 聚山梨酯80 無菌混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團后，慢慢加入45℃的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1∶20 的供試液。
方法2 取供試品10g，加至含20ml 無菌十四烷酸異丙酯（采用薄膜過濾法過濾除菌。選用孔徑為0.22μm的脂溶性濾膜，在140℃干熱滅菌2小時）和無菌玻璃珠的適宜容器中，必要時可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然后加入45℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，振搖5～10 分鐘，萃取，靜置使油水明顯分層，取其水層作為1∶10 的供試液。
(2)膜劑供試品
取供試品100cm2，剪碎，加100ml 的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（必要時可增加稀釋液），浸泡，振搖，作為1∶10 的供試液。
(3)腸溶及結腸溶制劑供試品
取供試品10g，加pH6.8 無菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或pH7.6 無菌磷酸鹽緩沖液（用于結腸溶制劑）至100ml，置45℃水浴中，振搖，使溶解，作為1∶10 的供試液。
(4)氣霧劑、噴霧劑供試品
取規(guī)定量供試品，置冰凍室冷凍約1 小時，取出，迅速消毒供試品開啟部位，用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉動容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器吸出全部藥液，加至適量的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（若含非水溶性成分，加適量的無菌聚山梨酯80）中，混勻，取相當于10g或10ml 的供試品，再稀釋成1∶10 的供試液。
(5)貼劑供試品
取規(guī)定量供試品，去掉貼劑的保護層，放置在無菌玻璃或塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有表面活性劑（如聚山梨酯80 或卵磷脂）的稀釋劑中，用力振蕩至少30 分鐘，制成供試液。貼劑也可以其他適宜的方法制備成供試液。
(6)具抑菌活性的供試品
當供試品有抑菌活性時，采用下列方法進行處理，以消除供試液的抑菌活性后，再依法檢查。常用的方法如下。
①培養(yǎng)基稀釋法 取規(guī)定量的供試液，至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內的供試品含量減少，至不含抑菌作用。測定細菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)時，取同稀釋級的供試液2ml，每1ml 供試液可等量分注多個平皿，傾注瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，培養(yǎng)，計數(shù)。每1ml 供試液所注的平皿中生長的菌數(shù)之和即為1ml的菌落數(shù)，計算每1ml 供試液的平均菌落數(shù)，按平皿法計數(shù)規(guī)則報告菌數(shù)；控制菌檢查時，可加大增菌培養(yǎng)基的用量。
②離心沉淀法 取一定量的供試液， 500 轉/分鐘離心3 分鐘，取全部上清液混合，用于細菌檢查。
③薄膜過濾法 見細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)項下的“薄膜過濾法”。使用的設備集菌儀或者在微生物限度檢查儀
④中和法 凡含汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試品，可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分。中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培養(yǎng)基中。
細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)
計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查
細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)用的培養(yǎng)基應進行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基均應檢查。
菌種 試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過5 代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0 代）。并采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。
大腸埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC（B） 44 102〕
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）〔CMCC（B） 26 003〕
枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B） 63 501〕
白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（F） 98 001〕
黑曲霉（Aspergillus niger）〔CMCC（F） 98 003〕
菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24 小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24～48 小時。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml 含菌數(shù)為50～100cfu 的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5～7 天，加入3～5ml 含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml 含孢子數(shù)50～100cfu 的孢子懸液。
菌懸液在室溫下放置應在2 小時內使用，若保存在2～8℃可在24 小時內使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2～8℃，在驗證過的貯存期內使用。
適用性檢查 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各50～100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2 個平皿，混勻，凝固，置30～35℃培養(yǎng)48 小時，計數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉各50～100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置23～28℃培養(yǎng)72 小時，計數(shù)；取白色念珠菌50～100cfu，注入無菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2 個平皿，混勻，凝固，置23～28℃培養(yǎng)72 小時，計數(shù)。同時，用相應的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述試驗。
結果判定 被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值大于70%，且菌落形態(tài)大小應與對照培養(yǎng)基上的菌落一致，判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。